La aventura continúa justo después de Assassin's Creed II. Ezio, tras hablar con la diosa Minerva, escapa de el Vaticano con la ayuda de su tío Mario y regresa a Monteriggioni donde les cuenta a los demásAssassins lo que vió en la cripta y lo que le contó Minerva. En Monteriggioni, Ezio recibe la visita de Caterina Sforza, la cual le pide ayuda para defender Forli de los ataques de los Borgia, Ezio le dice que la batalla de los Assassins ha terminado por el momento, pero justo al día siguiente, las fuerzas de César Borgia atacan Monteriggioni, Mario se lanza al ataque con los mercenarios pero es capturado y ejecutado por César, el mismo Ezio es herido al tratar de rescatarlo. De camino a Roma, Ezio cae desmayado de su caballo por las heridas recibidas.

Ya en el presente, Desmond, Lucy, Shaun y Rebecca huyen de los templarios llegando a la actual Monteriggioni, se instalan en la antigua cripta de los Assassins para proseguir en el uso del Animus.

De vuelta en Roma, Ezio se despierta en una casa, una mujer le dice que un hombre pagó por sus cuidados, Ezio se cura de sus heridas y se reúne con Nicolás de Maquiavelo, Maquiavelo le dice que los Borgia se han apoderado de Roma y buscan desesperadamente dominar toda Italia, y que además, cuentan con el apoyo del rey francés, Luis XII, Ezio recibe un escondite en Isla Tiberina de manos de Fabio Orsini, un amigo de Maquiavelo.

Ezio comienza a reunirse de nuevo con sus viejos compañeros, como El Zorro o Bartolomeo d'Alviano, que luchan contra el dominio de los Borgia, tras eliminar a la madame del burdel La Rosa en Flor, su madre María, y su hermana Claudia se hacen cargo del burdel, muy a pesar de Ezio. Tras eso, Caterina Sforza es capturada y trasladada para ser interrogada por Lucrecia Borgia, Ezio la rescata y la pone a salvo, Caterina decide marcharse a Florencia, ahora que Forli está en manos de los Borgia.

Ezio, Maquiavelo, Claudia y El Zorro traman un plan para acabar con los Borgia, Ezio se reúne con Egidio Troche, un senador de Roma, enemigo de los Borgia y cuyo hermano es cercano colaborador de ellos, Ezio libra a Egidio de sus problemas y este a cambio, le da la localización de un hombre apodado El Banquero, el cual lleva las cuentas de César Borgia, Ezio sigue aEl Banquero, cuyo nombre real es Juan Borgia, y lo asesina durante una fiesta.

Ezio se dirige ahora hacia las afueras de Roma, donde su viejo amigo, Bartolomeo d'Alviano, dirige a los mercenarios de la familia Orsini en la lucha contra los Borgia y su aliado francés, Octavien de Valois, tras rechazar a los soldados franceses, Ezio trama un plan para acabar con el barón de Valois, después de que este secuestre a Pantasilea, la esposa de Bartolomeo, Ezio se infiltra y asesina al barón, acabando con los refuerzos franceses de César.

Ezio ahora se reúne con El Zorro, para acabar con Micheletto Corella, el principal sicario y mano derecha de César Borgia, tras seguir a Micheletto, Ezio descubre que planea acabar con el nuevo amante de Lucrecia por órdenes de César, Ezio se enfrenta a Micheletto y sus hombres en el Coliseo romano, aunque no acaba con Micheletto. Entonces se apresura a detener a El Zorro, que planea matar a Maquiavelo, pensando que los espía para los Borgia.

Tras introducir a Claudia en los Assassins, Ezio y Maquiavelo descubren que César ha regresado a Roma y se dirige hacia el Castillo de Sant'Angelo, Ezio decide partir para acabar con toda la familia Borgia de una vez por todas, a través de una ventana en el castillo, Ezio ve como César acaba con la vida de su padre, Rodrigo Borgia y golpea a Lucrecia para que le cuente donde está escondido el Fruto del Edén, Ezio es más rápido y encuentra el fruto en una extraña figura, tras conseguir el fruto, Ezio acaba fácilmente con la vida de los soldados leales a César en Roma, y este se ve obligado a huir de la ciudad, cuando descubre que los cardenales le han retirado su apoyo.

Al mes siguiente, César llega a Roma dispuesto a reconquistar la ciudad con otro ejército, pero cuando pensaba que su ejército había llegado, César es arrestado por Fabio Orsini por orden del nuevo Papa, Julio II, con la orden de llevarle hasta Españadonde será encarcelado.

Tiempo después, César es hecho prisionero en Medina del Campo, en Castilla, pero logra escapar y llega hasta Navarra donde se pone al servicio del señor de Navarra para reconquistar el castillo de Viana, que estaba en poder del conde de Lerín, al mando de 10.000 hombres, César inicia el asedio del castillo, pero Ezio ya sabía su paradero y llega a Navarra, donde se enfrenta a César, Ezio lo derrota y lo arroja desde las murallas del castillo, acabando definitivamente con la vida de César.

En el presente, Desmond, Lucy, Shaun y Rebecca descubren donde está el paradero del Fruto del Edén y marchan hacia Roma, donde llegan a el Coliseo, el lugar donde Ezio escondió el fruto. Tras llegar a la cripta, Desmond y sus compañeros se disponen a coger el fruto, pero el tiempo se para y una voz extraña le habla a Desmond que se mueve de manera involuntaria, de repente, se acerca a Lucy y le clava la cuchilla, tras eso, cae desmayado.